1、准备工作:膜片钳实验大鼠胰腺β细胞的培养

①、150-200 g雄性大鼠禁食1-2天

②、照紫外：多个枪头。

③、灭菌：6个玻璃平皿、1个三角瓶、2个15 ml尖底离心管、2个10 ml 小瓶、1个玻璃吸管（棉花）、2个滤器、2个针管、3个移液管（棉花）、3个剪刀（1大2小）、1钳、2镊、1Tip吸头（塞棉花）、小盖玻片24片。

④、提前半小时打开恒温水浴，检查水位，调好温度（37℃）

2、分胰岛:膜片钳实验大鼠胰腺β细胞的培养

①、称Collagenase V 12-12.5 mg (12-12.5mg/5 ml)于小烧杯中。

②、拿出4℃KRBB缓冲液，加5ml于酶中，溶解后过滤于无菌小瓶中。

③、另各取3 ml于3个平皿中。取10 ml于15 ml离心管中。

④、杀鼠，取胰岛。一平皿中剪去胞膜、脂肪、淋巴结等，一平皿中清洗，一平皿中剪细胰腺，大小适中、均匀，60刀左右。

⑤、用玻璃吸管将胰腺组织转至15 ml离心管中，吹吸，自然沉降。

⑥、吸去上清，转入三角瓶，用玻璃吸管吹打。

⑦、37℃下150 rpm振荡25 min。玻璃吸管吹打（5 min一次），开始几次用力吹打，最后几次轻轻吹打。

⑧、加20 ml KRBB缓冲液终止消化（摇匀）。低速离心（100 rpm）1分钟。去上清。

⑨、20 ml KRBB缓冲液稀释。

⑩、挑胰岛（KRBB缓冲液中）。

3、分单细胞:膜片钳实验大鼠胰腺β细胞的培养

①、称1-1.5 mg Dispase II (1-1.5mg/3 ml)于小烧杯中。

②、加3 ml无钙无镁KRBB于小烧杯中。过滤于一小瓶中。

③、取胰岛于装有约7 ml的无钙无镁KRBB 15 ml 塑料离心管中，低速离心。

④、去上清。加入酶液，用1 ml微量移液器轻轻吹打。

⑤、37℃下150 rpm振荡10 min。中间用1 ml微量移液器吹打两次（可稍重），至微粒不大，但尚能看到时为止。

⑥、加培养液终止消化。700 rpm

⑦、加0.6 ml 培养液。

⑧、滴片（挑胰岛前在小盖玻片上涂Poly-lysine, 5min后用无菌水洗一次，24片）、置于培养箱（5% CO2, 37℃）。

⑨、15 min 后加培养液。培养箱中培养。开始两次12小时换液，以后24小时换液。

3仪器设备实验材料:

PP-830电极拉制仪(Narishige，Japan)、

CPM2电极涂敷抛光仪(Narishige， Japan)、

膜片钳系统由PC2C放大器(INBIO, China)、CELERON  850(Intel，USA)，PClamp 4.0 软件 (INBIO, China) 等组成、

Axiovert 100倒置显微镜(Zeiss, Germany)。

用SD MX7600压电微操纵器(Burleigh, USA)来控制电极。