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膜片钳技术在心血管研究中的应用

时间:2023-06-03     【原创】

  二十余年来,由于电压钳和膜片钳的应用,人们对心血管活动的认识不断更新和深入,不但使心血管本身的理论更加完善,而且推动了心血管的病理生理学、药理学和临床诊治技术的发展。迄今为止在心脏就发现不下十种离子通道,仅钾通道就有九种类型以上。由此可见,心脏功能的复杂性无不与其分布着众多的离子通道有关。同样,在心血管活动的研究中,由于膜片钳的应用,人们不仅对血管平滑肌电生理机制有了更多的了解,也大大促进了高血压、动脉粥样硬化等研究的深入。


  3.1 对心肌及血管平滑肌细胞膜离子通道的研究得到更进一步深入


  自Noma[4]于1983年在心肌细胞膜上首次发现ATP敏感的钾通道(KATP)以来,KATP在心肌缺血损伤的病理生理机制中的作用越来越引起了人们的关注。实验证明在生理条件下,心肌细胞内的ATP浓度为毫摩尔水平,这一浓度能明显抑制KATP通道。ATP/ADP比率轻度变化时,只有为数很少的KATP通道开放。因此,在生理条件下KATP通道未必起作用。但在缺血和其他代谢抑制的情况下,KATP通道即被明显激活。据Cole等[5]报道,预先给予格列苯脲可加重缺血再灌注损伤,实验研究表明冠脉内注射开放剂Cromakalin或Pinacidil可拮抗缺血所致的去极化,增加静息膜电位,使缺血所致心室颤动发生率降低和心肌梗死面积减少,甚至可恢复到缺血前水平。这些结果表明KATP通道开放对缺血再灌注心肌有保护作用。然而,急性心肌缺血时KATP通道激活所致的细胞外钾堆积是诱发严重室性心律失常的主要原因。因此,KATP通道激活也有其不利的方面。


  Furakawa等[6]对猫心外膜下和内膜下延迟整流钾电流(Ik)进行了比较,发现前者的Ik激活很快而失活则延迟,充分激活Ik的幅值和电流密度也较心内膜下高得多,他认为可能由于心内膜与心外膜所受压力不同所致。Kilborn等[7]测定了不同生长期(出生后1~10天)鼠心室肌外向电流变化,认为出生一天的小鼠心室肌细胞动作电位时程比生后10天的小鼠长,原因在于出生一天的小鼠心室肌细胞背景钾电流快失活成分少,慢失活成分多,瞬间外向钾电流通道对钾离子选择性低,两者导致动作电位时程延长。


  3.2 对心肌细胞收缩、舒张机理的进一步探讨


  哺乳动物心肌细胞膜去极化时,细胞外液Ca2+由钙通道进入细胞内,启动细胞兴奋收缩耦联。由于Ca2+通过钙通道内流是细胞兴奋收缩耦联的首要条件,因此研究Ca2+和钙通道及其调控为进一步阐明兴奋收缩耦联机制具有重要意义。O′Neill等[8]应用膜片钳和荧光探针两种方法进行研究后认为咖啡因可使鼠心肌细胞钙内向电流增加,流入胞浆的Ca2+诱导肌质网钙释放成为心肌收缩时胞浆内钙升高的主要原因。


  3.3 在血管壁张力改变机理研究中的应用


  大部分小动脉一般都以收缩状态的形式存在,它们进一步收缩或舒张主要依赖于血液的需求量。在微循环中,小动脉的平滑肌张力对外周血管阻抗及血压起着决定性作用。近年来应用膜片钳技术对血管平滑肌上的钙通道及钾通道进行了不少研究,迄今为止在平滑肌上已发现四种不同类型的钾离子通道[9]:①电压依赖性钾通道;②钙激活性钾通道(Kca通道);③内向整流性钾通道;④KATP。动脉平滑肌细胞上膜电位是动脉张力及动脉直径的主要调节者,而实验证明细胞膜电位主要是由钾离子通道来控制。动脉平滑肌细胞膜上钾离子通道开放可促进钾离子外流增加,并导致膜电位超极化,由于膜电位超极化的影响,结果膜上电压依赖性钙通道关闭,Ca2+内流减少,从而导致血管平滑肌舒张。许多内源性血管扩张剂如降钙素基因相关肽(CGRP)和adenosine等主要是通过激活ATP敏感性钾通道使平滑肌细胞超极化,降低血管壁张力,维持血管舒张状态。Wilde等[10]对成年犬冠状动脉游离的平滑肌细胞的研究中发现KCa通道能直接对抗Ca2+通道活动所致的膜去极化而引起膜超极化,提示这个通道可能在对抗冠脉平滑肌的去极化和紧张性中起着重要的保护作用。内毒素性休克出现的低血压现象可能与钾离子通道的过度激活有关。钾通道阻断剂将可使动脉平滑肌细胞膜去极化及血管收缩。事实证明TEA、ChTX、Iberiotoxin可使肌源性脑动脉及大鼠隐静脉收缩。降低血管内压力或阻断Ca2+通道以降低细胞内Ca2+浓度,并以此来降低主动脉张力,这将大大削弱钾通道阻断剂对膜电位和动脉张力的作用[11]。因此,血管平滑肌钾离子通道功能改变会导致一系列脉管系统疾病,如血管痉挛、高血压、心肌缺血以及内毒素性休克时出现低血压、糖尿病出现的血管反应性改变等。


  3.4 在心血管药理学研究中的应用


  随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用,对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新,而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”[2]。


  膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。近十年来心血管药物学研究最重要的成就就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮?酮和维拉帕米及其衍生物)[12],随着其在临床上不断应用,人们逐渐发现钙拮抗剂尽管有一定疗效,但其负性肌力作用及反射性交感兴奋作用是其缺陷。因此目前人们普遍认为进一步开发作用于钾离子通道的药物更为理想。但由于钾通道的类型较多,药物对通道的选择性很重要,Ik被认为是理想的药物作用靶子。Ⅲ类抗心律失常药如索他洛尔、溴苄胺、二甲苄胍、UK68798、BTHP及新开发药E-4031等均可延长APD,减少复极时的外向电流,实验表明这些药物的抗心律失常、抗心室颤动作用与它们阻滞心肌细胞膜Ik密切相关。另外,在某些情况下,药物对KATP的影响、对心律失常及心肌缺血的发生和预后可能产生重要作用。如单细胞膜片钳实验证明RP49356、Cromakalim、Pinacidil可激活心肌细胞膜KATP。在犬心房肌,Cromakalim、Pinacidil、Nocrandil产生负性肌力作用的PD2值分别为6.11,3.37,4.55。Pinacidil及Cromakalim等对离体的缺血心脏有保护作用,其机理是由于开放了KATP,用优降糖可完全对抗它们对再灌流的保护作用。钾通道开放剂的临床评价还在探索阶段,但此类药物近期疗效肯定,降压而不减少肾血流量,扩张冠脉但不引起冠脉“盗血”现象,因而具有良好前景,如新近研制及开发的一批新药NS-400、EMD52692、Nicorandil等。


  4 结束语


  膜片钳技术的创立取代了电压钳技术,是细胞电生理研究的一个飞跃,使得离子通道的研究,从宏观深入到微观,使昔日的“肉汤生理学(broth physiology)”与“闪电生理学(lightning physiology)”在分子水平上结合起来,使人们对膜通道的认识耳目一新。当前,生理学、生物物理学、生物化学、分子生物学和药理学等多种学科正在把膜片钳技术和膜通道蛋白重组技术、同位素示踪技术和光谱技术等非电生理技术结合起来,协同对离子通道进行全面的研究。不少实验室已经将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道的功能而达到治疗的目的。

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