双光子显微镜成像原理不同于单光子，双光子成像需要同时用2个光子去激发荧光信号，使其跃迁到激发态，在从激发态回到稳态过程中就会释放能量从而发光，双光子膜片钳技术的优势在于成像分辨率很高，因为需要两个光子在同一焦面激发荧光，所以成像时候不会产生很强的背景噪声，故而其成像分辨率可以精确到一个spine，结合钙信号，是可以直接记录spine 的spike，此外，双光子膜片钳技术可以激发波长600~1020范围的激光，长波长的激光可以穿透300-400微米的组织，故而在in vivo水平，是可以直接使用其去成像。

       借助于双光子显微镜，我们是可以直接在in vivo水平做膜片钳记录，目前主要用in vivo下的cell-attach和whole-cell两种技术，更多的人是借助于双光子靶向膜片钳技术做钙成像，毕竟钙成像效率很高，但是钙成像在使用过程中，具有延迟的劣势，其次信噪比很差，很多比较弱的信号不能分辨，做in vivo水平做记录，有许多说不清的原因，诸如动物自身呼吸引起的组织颤动，前期手术处理很复杂，很费时，在脑片水平，双光子显微镜应用更加广泛，可以直接定点激活一个细胞，

       目前存在的问题是，双光子靶向膜片钳技术在激活一个细胞的过程中，由于激光范围小能量不足，很多时候很难得到激活信号，具体解决方法，有两种：

       一种是通过棱镜再次放大激光范围，实现较大单位的同时激活细胞表面更大范围，从而激活细胞，此外另一种思路就是短时间内在细胞表面快速移动激光位点，实现累积激发，从而让一个细胞被激活，如果日后膜片钳技术成熟，将不再需要利用dual-patch技术去研究神经元直接连接的相关问题，毕竟后者的工作量大，工作效率低。

       总结一下，借助于双光子靶向膜片钳技术，我们可以实现单细胞水平的分辨率，故而可以在in vivo水平下对单个细胞做whole-cell和cell-attach记录，因为是在in vivo水平下，所以就可以在细胞水平研究mice在参与某种行为时候的神经机制。