培养的心肌细胞做膜片钳的准备？

       胚胎心肌细胞的分离及培养(在无菌条件下操作)：将所需要胎龄的孕鼠取出，以颈椎脱臼法处死后，剪开腹腔，找到子宫, 取出胚胎，置于冰PBS(mmol/L)溶液（NaCl 120、 KCl 5.4、 MgSO4 5、 Na-Pyruvate 5、 Taurine 20、 HEPES 10、 Glucose 20）中。

       去掉胎膜及胎盘，用尖镊子将心脏取出放入另一盛有冷PBS培养皿中，置于体视显微镜下，分离出心房和心室（在10.5 d之前，心房尚未发育）。把心房和心室剪碎分别置于酶解液中（Collagenase B：1mg/ml, Roche Molecular Biochemicals, Mannheimm, Germany; CaCl2 10mmol/L, 3μl/ml）酶解，温度37 ℃，时间35~37 min。用KB(mmol/L)液（KCl 85、K2HPO4 30、 MgSO4 5、 EGTA 1、Na2ATP 2、 Pyruvate 5、Kreati 5、 Taurine 20、 Glucose 20）终止消化并震荡30 min后，将分离下来的单个心肌细胞（大约5×105~1×106个/ml）2~3滴滴入预先放有盖玻片（预铺明胶）的培养皿中，加含有20%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco公司），置于37℃,5%CO2培养箱中培养。24 h后，选用跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。

       利用膜片钳技术进行离子通道研究时，要求细胞形态结构完整、平滑，以利于和玻璃微电极进行高阻抗封接，并且在破膜形成全细胞记录方式后，细胞能保持较好的活性。因而，制备高质量的单个细胞是完成膜片钳实验的关键，然而，再分离细胞的过程中，有很多因素如溶液的成分、pH，酶，温度等都会影响分离细胞的数量和质量。

       本文所用的方法不仅获得的细胞数量多，而且由于我们分离获得的单个细胞是长在盖玻片上，所以细胞贴壁牢固，用于做膜片钳实验效果好。经24 h培养后细胞状态良好，胚胎心肌细胞跳动。我们的成功经验与体会是：

(1)迅速取出胚胎，快速去掉胎膜和胎盘，以免胚胎缺氧。

(2)温度是影响分离细胞成功率的重要因素，取出的胚胎心脏要置于4℃的PBS溶液中，可减弱心肌组织的代谢，从而保护心脏组织。

(3)酶也是影响分离细胞成功率的关键因素。一般成年鼠心肌细胞的分离使用I型胶原酶，由于胚胎心肌组织娇嫩，故我们选用胶原酶B,一种较温和的消化酶进行消化。

(4)细胞的密度;由于消化分离出的细胞要培养24h，故将分离出的单个细胞滴在盖玻片的数目不要太多，以免长成片，而不能进行单个细胞的膜片钳实验。

(5)细胞在分离过程中要保持无菌，否则细胞受到污染后生长不好，细胞状态也不好。