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脑片膜片钳实验方法

时间:2022-02-27     【原创】

       脑片膜片钳选择海马是中枢神经系统研究中应用较为广泛标本之一。其原因有以下几点:1、海马与脑的其它部位相对隔离,较易剥离,且剥离后受到的损伤较小;2、海马具有高度分化的片层结构,一方面,海马神经环路在片层中的分布有一定的空间规律,如锥体细胞胞体分布在锥体细胞层,而雪氏侧支突触分布于辐射层,且海马中存在一个三突触联系的回路,即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏侧支-CA1区锥体细胞层等,因此,在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应;另一方面,这种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。这些都使海马成为脑片膜片钳电生理学研究的理想标本。本文对海马脑片膜片钳的操作规程及注意事项总结如下。


一、海马脑片膜片钳的制备


       脑片制备中,海马分离应在断头后10分钟内完成,5~6分钟为宜。在分离海马时,还应注意不要扭转或撕扯海马,更不要损伤海马。分离海马的速度和质量是保证海马脑片制备成功的关键所在。


       评价脑片活性简单的方法是记录脑片上的群峰。在一个状态良好的脑片上记录到的群峰在一个很宽的刺激强度范围内始终是单峰的。出现多个群峰往往提示抑制性突触功能已受损,这是脑片早的病理生理学改变。如果仅存在突触前纤维群峰(Fiber Volley, FV),或FV峰大于突触后反应,这提示脑片活性极差,有活性的突触已所剩无几,为激发突触反应需要更多的突触前纤维参与,需中止实验。在活性较好的脑片中,FV峰几乎探测不到,或远远小于突触后反应。


       有时会莫名其妙地出现一些问题,突触标本中突触后神经元看上去状态良好,但做了很多天甚至几周都没有得到有用的数据。在这种情况下,须要耐心地思考失败的原因,并设法解决。首先,应该检查溶液,用其它实验室制备的标本或更换实验动物。对于脑片的制备而言,切片机出现的机械故障会损坏脑片的质量。总之,在实验的全过程中能尽量注意每一个细节问题,出现问题后反复尝试,实验就会容易起来。


二、海马脑片膜片钳记录


1、将刺激电极放置在含突触前纤维脑片区域附近


       在突触传递的研究中,应该同时记录突触前和突触后神经元的电信号,虽然,并不是所有突触前神经元胞体的动作电位均可传导至突触 (Vincent, 1996)。由于在突触前和突触后两个神经元上同时做膜片钳记录较困难,因此,需要用其它的方法来诱发突触前动作电位的发放。用刺激电极可在单个或多个突触前细胞或轴突诱发动作电位。另外,还可以用局部施加神经递质的方法来诱导动作电位,如用短促的压力、离子电泳或笼锁谷氨酸光解等方法将谷氨酸加到突触前胞体或轴突上,可以诱导出多个动作电位。


       用电极刺激 在神经元培养皿中,可以用连接了电源(通常是膜片钳放大器)的微电极直接刺激突触前神经元。在这种情况下,通常需要用负压吸引使突触前的细胞贴紧刺激电极,防止刺激电流的逸出。通过膜片钳放大器给脉冲刺激的优点是,它可以记录到突触前细胞被激活的胞外电信号(Role, 1987)。从培养的神经元和脑片上找到有突触联系的一对神经元是很困难的,但在神经元培养中有单个神经元的Autapic突触就会方便许多。


       可以用脑片膜片钳电极或尖端较细的一对钨电极给突触前轴突纤维施加电压脉冲。用电极刺激可将Ag/AgCl电极置于孵育槽中与其构成一电流回路。刺激电流一定要与膜片钳放大器记录电路隔离开,以防止刺激电流漏入记录电极中,而使刺激尾迹变得很大。为此,施加刺激需要一个未接地的隔离器。隔离器可以用外界脉冲刺激或计算机来控制。另外,还需要将刺激尾迹缩小到最小,以排除其对突触信号起始段的干扰。为达到该目的,需将刺激电路的回路电极置于合适的位置或用膜片钳放大器提高串联电阻补偿的效率。


       刺激电极的位置通常将刺激微电极或刺激电极置于突触前轴突通过的部位。但有时突触前轴突在制备脑片时即被去除。如果脑片制备时局部神经环路被破坏,实验中就很难成功地记录到突触后电流。实际上,切脑片的角度是保存局部神经环路最重要的因素之一,合适的角度既可使突触后神经元保存完好,也可保留部分较长的突触前纤维用于电刺激。用胞外电极刺激激活的神经纤维较多,而且,每次刺激激活的纤维数目也会不同。如果实验目的是将不同的传导通路分开,那么,必须要证明两个刺激电极激活的纤维各不相同。

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