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详细内容

膜片钳实验——大鼠胰腺β细胞的培养

时间:2021-12-22     【原创】

1、准备工作:膜片钳实验大鼠胰腺β细胞的培养

①、150-200 g雄性大鼠禁食1-2天

②、照紫外:多个枪头。

③、灭菌:6个玻璃平皿、1个三角瓶、2个15 ml尖底离心管、2个10 ml 小瓶、1个玻璃吸管(棉花)、2个滤器、2个针管、3个移液管(棉花)、3个剪刀(1大2小)、1钳、2镊、1Tip吸头(塞棉花)、小盖玻片24片。

④、提前半小时打开恒温水浴,检查水位,调好温度(37℃)

2、分胰岛:膜片钳实验大鼠胰腺β细胞的培养

①、称Collagenase V 12-12.5 mg (12-12.5mg/5 ml)于小烧杯中。

②、拿出4℃KRBB缓冲液,加5ml于酶中,溶解后过滤于无菌小瓶中。

③、另各取3 ml于3个平皿中。取10 ml于15 ml离心管中。

④、杀鼠,取胰岛。一平皿中剪去胞膜、脂肪、淋巴结等,一平皿中清洗,一平皿中剪细胰腺,大小适中、均匀,60刀左右。

⑤、用玻璃吸管将胰腺组织转至15 ml离心管中,吹吸,自然沉降。

⑥、吸去上清,转入三角瓶,用玻璃吸管吹打。

⑦、37℃下150 rpm振荡25 min。玻璃吸管吹打(5 min一次),开始几次用力吹打,最后几次轻轻吹打。

⑧、加20 ml KRBB缓冲液终止消化(摇匀)。低速离心(100 rpm)1分钟。去上清。

⑨、20 ml KRBB缓冲液稀释。

⑩、挑胰岛(KRBB缓冲液中)。

3、分单细胞:膜片钳实验大鼠胰腺β细胞的培养

①、称1-1.5 mg Dispase II (1-1.5mg/3 ml)于小烧杯中。

②、加3 ml无钙无镁KRBB于小烧杯中。过滤于一小瓶中。

③、取胰岛于装有约7 ml的无钙无镁KRBB 15 ml 塑料离心管中,低速离心。

④、去上清。加入酶液,用1 ml微量移液器轻轻吹打。

⑤、37℃下150 rpm振荡10 min。中间用1 ml微量移液器吹打两次(可稍重),至微粒不大,但尚能看到时为止。

⑥、加培养液终止消化。700 rpm

⑦、加0.6 ml 培养液。

⑧、滴片(挑胰岛前在小盖玻片上涂Poly-lysine, 5min后用无菌水洗一次,24片)、置于培养箱(5% CO2, 37℃)。

⑨、15 min 后加培养液。培养箱中培养。开始两次12小时换液,以后24小时换液。

3仪器设备实验材料:

PP-830电极拉制仪(Narishige,Japan)、

CPM2电极涂敷抛光仪(Narishige, Japan)、

膜片钳系统由PC2C放大器(INBIO, China)、CELERON  850(Intel,USA),PClamp 4.0 软件 (INBIO, China) 等组成、

Axiovert 100倒置显微镜(Zeiss, Germany)。

用SD MX7600压电微操纵器(Burleigh, USA)来控制电极。

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